Il Corona virus (con i suoi indesideratissimi “fratelli”) è stato scoperto oltre mezzo secolo fa ma…….. di Roberto Volterri.

 

Immagine di apertura: una ricercatrice con il suo microscopio ottico.

 

 

Dedicato a tutti coloro che hanno sofferto e stanno

soffrendo a causa del Virus cinese Covid19.

 

 

Il Corona virus (con i suoi indesideratissimi “fratelli”) è stato scoperto oltre mezzo secolo fa ma si può osservare soltanto al Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

Brevissimi cenni su questa particolare tecnica…

 

di Roberto Volterri

 

 

L’immagine più diffusa di un qualsiasi ricercatore nel campo della microbiologia al lavoro nel suo laboratorio è quella che lo vede chinato sull’oculare di un professionale Microscopio ottico…

 

Ma i Virus, a causa delle loro piccolissime dimensioni – comprese tra 20 e 300 nanometri (nm), ovvero la milionesima parte del millimetro – non sono visibili al Microscopio ottico che permette ingrandimenti di poco superiori ai 1000X, mille ingrandimenti, utili soltanto per osservare i Batteri aventi dimensioni dell’ordine di pochi micrometri (µm), cioè ben mille volte più grandi.

 

2. Immagine sopra: Micrografia di Batteri osservati al Microscopio Ottico

 

Le immagini del famigerato Corona virus (che da circa un anno ci affligge!) come sono state ottenute e come si è arrivati all’impiego della Electron Scanning Microscopy nell’osservare e identificare i Corona virus?

 

Correva l’anno 1964…

 

Una giovane ricercatrice – non ancora laureata – June Hart, successivamente conosciuta come June Almeida dal cognome del marito – lavorava con il dottor Davida Tyrrel il quale stava indagando sul comune raffreddore studiando… le secrezioni nasali di alcuni volontari,

Un campione marcato con la sigla B814 proveniente da uno studente di un locale collegio, osservato al Microscopio Elettronico a Scansione – più avanti vedremo come funziona – appariva molto diverso dai Virus conosciuti.

June Alemida, per indagare in maniera più approfondita, ebbe allora la geniale intuizione di applicare una tecnica già da lei stessa sperimentata presso all’Ontario Cancer Institute di Toronto.

Sullo schermo del SEM (Scanning Electron Microscope) apparve un punto grigiastro, di forma vagamente sferica, con intorno una sorta di alone composto da piccolissimi “raggi” che davano l’impressione di vedere il Sole con la sua “corona”.

Da qui il nome dato a tutta una serie di Virus il cui “VIP” – il Corona virus 19, per i suoi… nemici solo e soltanto Covid 19 – è rappresentato da quello che ha creato la pandemia che ha sovvertito l’ordine mondiale…

 

3. Immagine sopra: June Almeida al lavoro con un TEM (Transmission Electron Microscope), molto diverso dal SEM ma in grado di fornire ingrandimenti ben maggiori, fino a circa 50.000.000 X!

 

June Almeida utilizzò la tecnica conosciuta come Immunoelettromicrospia (IEM) prelevando gli anticorpi prelevati da individui infettati dai Virus poiché gli anticorpi li riconoscono grazie agli antigeni presenti sulla superficie del “nemico”, i Virus stessi. Pertanto, se sul campione in esame vengono introdotte particelle ricoperte dagli anticorpi, esse si riuniscono intorno al “nemico” rendendolo quindi facilmente identificabile. Ovviamente solo con Microscopi Elettronici!

Il Microscopio Elettronico a Scansione – con cui chi scrive lavora da decenni ma nel campo dello studio dei metalli e di reperti archeologici – purtroppo non fornisce immagini a colori. Quindi per ottenere le “belle” – si fa per dire! – fotografie alle quali ci siamo abituati da un po’ di tempo a questa parte, si usano dei “coloranti” costituiti da sali di metalli pesanti, quali ad esempio Ssali di Tungsteno, che incrementano la dispersione di elettroni – ovvero il “segnale” che opportunamente processato dall’apparecchio fornisce l’immagine finale – intorno al campione da osservare. Quando i Virus risultano investiti da tale “nube elettronica” si ottengono immagini poi facilmente modificabili in falsi colori.

 

4. Immagine sopra: Normale immagine dei Corona Virus ottenibile con il Microscopio Elettronico a Scansione (SEM)

 

 

5. immagine sopra: “Artistica” immagine dei Corona virus al SEM, ottenuta ricorrendo a particolari artifici,

Dopo questa necessaria premessa è forse giunto il momento di illustrare – “brevissimi cenni” sulla Microscopia Elettronica a Scansione, state tranquilli! – come funzionano tali costose e complesse apparecchiature…

 

 

“Brevi cenni” sul Principio di funzionamento della Microscopia Elettronica a Scansione (SEM) e della Microanalisi a Dispersione di Energia (EDS).

 

La nascita e lo sviluppo di strumenti elettro-ottici come il Microscopio Elettronico a Scansione – o SEM, acronimo di Scanning Electron System – sono strettamente legate a tre tappe fondamentali della Fisica:

1. scoperta dell’elettrone, nel 1897, da parte di J.J.Thomson.
2. proposta, da parte di L.de Broglie nel 1924, della ‘teoria ondulatoria della materia’.
3. dimostrazione, nel 1926, da parte di H. Bush che i campi elettrici e magnetici a simmetria assiale agiscono come ‘lenti’ nei confronti di elettroni e di altre particelle dotate di carica elettrica.

 

Tutto ciò dette infatti origine alla nuova scienza denominata ‘Ottica elettronica’ e fornì le basi al fisico Ernst August Friedrich Ruska per costruire, nel 1934, un primo Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM) e ad un altro fisico, il Knoll, per concepire nel 1935 quello a ‘scansione’, realizzato nel 1938 da Manfred von Ardenne aggiungendo solo le bobine necessarie allo spostamento del ‘pennello elettronico’.

 

 

6-7. Immagini sopra e sotto: un moderno Microscopio Elettronico in Trasmissione (TEM) e un altrettanto recente Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

 

 

8: Immagine sopra: Ernst August Friedrich Ruska (1906 – 1988), inventore del primo Microscopio Elettronico in Trasmissione.

9. Immagine in basso: Manfred von Ardenne (1907 – 1997) inventore del Microscopio Elettronico a Scansione.

 

Venne poi, nel 1942, Zworykin con notevoli perfezionamenti e con la progettazione di un Microscopio che permetteva una ‘risoluzione’ prossima a 50 nanometri.

Dopo il secondo Conflitto Mondiale ulteriori perfezionamenti furono apportati dal gruppo di ricercatori francesi guidati dal fisico Lecaute e dai ricercatori inglesi capeggiati dal fisico Oatley, perfezionamenti che condussero alla commercializzazione di questi fondamentali strumenti.

Ma come funziona un Microscopio Elettronico a Scansione?

Di seguito è riportato lo schema a blocchi di tale tipo di Microscopio, schema che aiuterà nel comprenderne il principio di funzionamento.

Un filamento di Tungsteno, posto sulla sommità di una colonna cava di metallo in cui viene praticato un vuoto abbastanza spinto, viene alimentato da un’appropriata tensione elettrica in modo che – per effetto termoionico – esso possa emettere elettroni.

Questi ultimi, emessi in tutte le direzioni, vengono convogliati da un cilindro forato chiamato ‘elettrodo di Wenhelt’ verso una zona (cross-over) ove si forma l’immagine della sorgente di ‘illuminazione’ (gli elettroni stessi). Successivamente un’altro elettrodo forato – l’anodo – a cui viene applicata una tensione positiva variabile tra 0 e 35.000 Volt provvede ad accelerarli verso il campione da esaminare.

Lungo la colonna sono poste delle ‘lenti elettroniche’ costituite da bobine opportunamente alimentate, mentre altre bobine consentono la ‘scansione’ del fascio di elettroni (il ‘pennello elettronico’) sulla superficie da esaminare.

Gli elettroni, colpendo il campione (che deve essere un buon conduttore di elettricità o reso tale mediante particolari tecniche di deposizione di un sottilissimo strato metallico) danno origine a vari effetti fisici, tra cui l’emissione di elettroni secondari ed elettroni retrodiffusi che costituiscono i principali segnali elettrici necessari a ricostruire l’immagine su un apposito display.

Dal campione osservato vengono emessi anche raggi X, ma di questi parleremo fra breve.

 

 

10. Immagine sopra: Schema a blocchi di un tipico Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

Viene schematizzata la colonna in cui è praticato un vuoto abbastanza elevato, il filamento che ha il compito di emettere gli elettroni, le varie ‘lenti elettroniche’, il campione su cui viene focalizzato il ‘pennello di elettroni’ e tutto il sistema elettronico che consente l’elaborazione e la visualizzazione della zona esaminata.

 Gli elettroni emessi dal campione vengono raccolti da un apposito rivelatore, trasformati in un segnale elettrico, processati da un’adatta ‘catena elettronica’ e inviati finalmente ad un ‘tubo a raggi catodici’ – simile a quello di un comune monitor b/n per Computer – che fornirà l’immagine della zona ‘scansionata’.

 

 

11. Immagine sopra: Sono qui indicati i vari segnali che scaturiscono dal volume di interazione (colloquialmente chiamato “pera” a causa della sua struttura) di un campione quando viene colpito dal ‘pennello elettronico’. Soprattutto gli ‘elettroni retrodiffusi’ e quelli ‘secondari’ forniscono il segnale per visualizzare sul monitor la superficie del campione esaminato. I ‘raggi X‘ forniscono invece il segnale che consente l’analisi qualitativa e quantitativa degli elementi presenti sulla stessa superficie.

Una peculiarità delle immagini ottenibili con questo tipo di Microscopio è l’elevata ‘profondità di campo’ che le rende quasi ‘tridimensionali’, come è possibile constatare dalla seguente micrografia al SEM di una cellula infettata dal Virus dell’HIV, prodromo dell’AIDS!

 

12. Immagine sopra: I Virus dell’HIV sono le piccole particelle blu che aggrediscono la cellula colorata in giallo.

Infine, la stessa immagine visibile sul monitor è registrabile su supporto fotografico o memorizzabile come comune immagine JPEG.

Abbiamo detto che l’interazione tra gli elettroni e la materia costituente il campione dà origine all’emissione di raggi X: bene, questa radiazione consente di effettuare anche l’analisi chimica – qualitativa e quantitativa – degli elementi costituenti il campione in esame.

 

13. immagine sopra: Tipico Spettro di Microanalisi EDS ottenuto da Roberto Volterri su un campione di polveri metalliche.

 

14. Immagine sopra: Polveri metalliche osservate a 2500X (il doppio di un buon Microscopio ottico) al SEM dall’autore dell’articolo. L’immagine ottenuta si potrebbe definire “tridimensionale”! Il segmento in basso a destra, 10 micron, fornisce un’informazione sulle piccolissime dimensioni delle polveri osservate.

 

 

15. Immagine sopra: Analisi quantitativa del campione osservato al SEM: ossidi di Alluminio e Rame con piccola quantità di Carbonio

 

Già dal 1913 il fisico H. Moseley aveva infatti scoperto che la frequenza (e l’energia) della radiazione X caratteristica emessa da un campione eccitato da un fascio di elettroni è funzione del ‘numero atomico Z’, degli elementi presenti nel campione stesso.

Nel 1949 un altro fisico, R. Castaing, studiò un particolare strumento – la microsonda elettronica – che utilizzava un ‘pennello elettronico’, focalizzato da ‘lenti magnetiche’, e da rivelatori costituiti da particolari cristalli.

Sette anni più tardi fu commercializzato il primo strumento analitico basato sulle esperienze del Castaing, strumento poi migliorato da V.E. Cosslett e P. Ducumb con l’introduzione di un sistema di bobine di scansione e la produzione di ‘mappe microanalitiche’ su un tubo a raggi catodici, similmente a quanto ottenuto in precedenza con il SEM.

In pratica, l’analisi dello spettro di energia dei raggi X emessi dal campione quando vienne colpito dal ‘pennello elettronico’ e rivelati da un apposito ‘detector’ consente di determinare sia dal punto di vista qualitativo che quantitativo la composizione chimica del campione stesso. Tale tecnica viene denominata Microanalisi a Dispersione di Energia o EDS (acronimo di Energy Dispersion Spectroscopy).

Sul monitor appaiono dei picchi caratteristici dei vari elementi chimici: dalla loro posizione nella scala delle energie (riportata in ascisse) si può risalire alle specie atomiche corrispondenti (analisi qualitativa).

Per ottenere anche informazioni di tipo quantitativo, cioè le percentuali delle diverse specie atomiche, si prendono in considerazione le intensità relative dei picchi corrispondenti ai vari elementi chimici. Opportuni software consentono infine di determinare le percentuali cercate.

Il sistema di Microanalisi a Dispersione di Energia consente anche di ottenere – come accennato prima –’mappe’ che forniscono la distribuzione degli elementi chimici presenti sulla superficie del campione esaminata.

 

(Roberto Volterri)

 

 

16. Immagine sopra: Esempio di Mappe Microanalitiche ottenute al SEM da Roberto Volterri: in falsi colori è indicata la localizzazione sul campione dei vari elementi chimici individuati (Alluminio, Silicio, Potassio, Calcio, Magnesio, ecc.)

 

 

Le immagini sono state fornite dal professor Roberto Volterri.

 

17. immagine sopra: L’autore dell’articolo con un moderno Microscopio Elettronico a Scansione munito di Microanalisi EDS, con cui ha effettuato molte indagini anche su reperti archeologici. Si vede anche l’immagine sullo schermo e, in alto, la relativa composizione chimica. Questo SEM può ingrandire fino a 180.000X mentre un qualsiasi Microscopio ottico ingrandisce solo fino a 1000X o poco più.

 

Leggendo questo recente libro vi avventurerete nei meandri di una strana villa, al confine con la Liguria, in cui operò un geniale (o folle?) medico di origine russa alla perenne ricerca di qualcosa che potesse avvicinare l’Uomo all’eternità. Poi, l’insondabile mistero dell’evanescente confine tra la vita e la morte, insieme agli esperimenti ai quali si dedicarono Luigi Galvani e Giovanni Aldini nel tentativo di correlare le attività biologiche con i nascenti studi sull’elettricità, di certo vi coinvolgerà totalmente. Scoprirete, inoltre, creature assassine, forse affette da Licantropia; leggerete di alcuni sventurati individui colpiti da impensabili e mostruose patologie, di incredibili anatre vegetali e di agnelli che nascono sugli alberi…